Mit dem 1. FC Eintracht Bamberg und der SpVgg Unterhaching II als Nachrücker an Stelle der SpVgg Bayreuth und der Sportfreunde Siegen startet die neue dreigleisige Regionalliga am 16. August 2008 in ihre erste Saison.
Daher komplettiert nunmehr die zweite Mannschaft der SpVgg Unterhaching das Feld der nachfolgenden 54 Vereine/Kapitalgesellschaften der neuen dreigleisigen Regionalliga, über deren endgültige Einteilung das DFB-Präsidium am 4. Juli 2008 entscheidet.
Absteiger aus der Regionalliga Nord: Rot-Weiss Essen, Borussia Dortmund II, SC Verl, 1. FC Magdeburg, Energie Cottbus II, SV Babelsberg, Hamburger SV II, VfB Lübeck, VfL Wolfsburg II.
Absteiger aus der Regionalliga Süd: SV Elversberg 07, KSV Hessen Kassel, SSV Reutlingen 05, TSV 1860 München II, SC Pfullendorf, Karlsruher SC II, FSV Ludwigshafen-Oggersheim.
Aufsteiger aus der Oberliga Bayern: SpVgg. Greuther Fürth II, 1. FC Nürnberg II, TSV Großbardorf
Nachrücker: 1. FC Eintracht Bamberg, SpVgg. Unterhaching II.
Aufsteiger aus der Oberliga Baden-Württemberg: SC Freiburg II, SSV Ulm 1846, SV Waldhof Mannheim, 1. FC Heidenheim.
Aufsteiger aus der Oberliga Hessen: SV Darmstadt 98, SV Wehen-Wiesbaden II, SV Viktoria Aschaffenburg, Eintracht Frankfurt II.
Aufsteiger aus der Oberliga Südwest: FSV Mainz 05 II, Eintracht Trier, 1. FC Kaiserslautern II, Wormatia Worms.
Aufsteiger aus der Oberliga Nordrhein: Borussia Mönchengladbach II, Bayer Leverkusen II, 1. FC Köln II, 1. FC Kleve.
Aufsteiger aus der Oberliga Westfalen: Preußen Münster, FC Schalke 04 II, VfL Bochum II, Sportfreunde Lotte.
Aufsteiger aus der Oberliga Nord: BV Cloppenburg, Holstein Kiel, Altona 93, SV Wilhelmshaven, Hannover 96 II, FC Oberneuland Bremen.
Aufsteiger aus der Oberliga NOFV Nord: Hertha BSC Berlin II, FC Hansa Rostock II, Türkiyemspor 1978 Berlin.
Aufsteiger aus der Oberliga NOFV Süd: Hallescher FC, Chemnitzer FC, VFC Plauen; ein Aufsteiger aus den Aufstiegsspielen zwischen Greifswalder SV 04 und FC Sachsen Leipzig (Hinspiel 2:4; Rückspiel am Samstag, 21. Juni, um 13 Uhr in Leipzig).